lunes, 24 de mayo de 2010

TÉCNICAS BIOTECNOLÓGICAS PARA LA ELABORACIÓN DE CULTIVOS IN VITRO

LA MICROPROPAGACIÓN



La micropropagación o propagación clonal, es una de las aplicaciones más generalizadas del cultivo in vitro,A partir de un fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme, con plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. El explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23°C,además de Controlar la cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales minerales, vitaminas reguladores de crecimiento,azúcar, agua y agar. La composición del medio depende de la especie vegetal y de la etapa del proceso de micropropagación.
Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores no biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro , incluyendo:

• Ambiente químico
• Composición del medio de cultivo
• pH
• Ambiente físico
• temperatura
• luz y fotoperíodo
• humedad

Dentro del proceso de micropropagación diferenciamos varias fases o etapas:

• 0: Selección y Preparación de la planta madre
• 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas
• 2: introducción del material seleccionado in vitro
• 3: Multiplicación de brotes
• 4: Enraizamiento
• 5: Aclimatación

Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in vitro ; puede ser aplicada a diferentes especies vegetales, en cada caso se podrán incluir simplificaciones o cambios de acuerdo a las características de las plantas, pero en términos generales son comunes al proceso de propagación in vitro. Figura 1. La micropropagación vegetal. A partir de una planta madre se obtienen numerosos explantos que, sujetos a condiciones y medios de cultivo adecuados, darán lugar a nuevas plantas iguales a la planta original, permitiendo su multiplicación.

FASE 0:

PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE


Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

FASE 1:

DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL


Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5a 15 minutos,seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

FASE 2:

INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

FASE 3:

MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas.
El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

FASE 4:

ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS


Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

FASE 5:

ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.
La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales invivo):

In vitro

• No realiza fotosíntesis
• Crecimiento en condiciones controladas
• Crecimiento en condiciones de asepsia
• Alta humedad relativa
• Estomas no funcionales
• Ausencia de pelos radiculares
• Ausencia de cera en la cutícula

In vivo

• Realiza fotosíntesis
• Crecimiento en condiciones no controladas
• Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente
• Humedad relativa variable
• Estomas funcionales
• Presencia de pelos radiculares
• Presencia de cera en la cutícula




Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada.
La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando.
Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.
Desde el año 1991, el Laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Unidad de Biotecnología de INIA, localizado en la Estación Experimental “Las Brujas”, ha estado trabajando en el ajuste de sistemas de multiplicación in vitro para diversas especies. El objetivo de estos trabajos de investigación es incorporar la micropropagación, como herramienta a los programas de mejora genética de INIA, en diferentes especies para acelerar y optimizar los procesos de evaluación a campo. Las especies vegetales estudiadas han sido: papa, boniato, ajo, frutilla, manzano, ciruelo, duraznero, peral, vid, frambuesa,zarzamora, arándanos, eucaliptos, marcela, especies aromáticas, especies forrajeras y otras.
A través de la propagación in vitro se ha podido disponer de material vegetal en diversas especies para su evaluación rápida. En especies como papa y frutilla, esta técnica está incorporada al esquema de selección y propagación del programa nacional de mejoramiento de hortalizas, todos los años se introducen clones de interés, obtenidos a partir de cruzamientos controlados. La multiplicación in vitro, permite la obtención de material con condiciones de sanidad superiores a los obtenidos por vía convencional. Las especies leñosas como los frutales de hoja caduca y especies forestales, en general necesitan medios de cultivo más complejos, la respuesta a las condiciones de cultivo resulta más lenta que en las especies herbáceas. A pesar de las dificultades que plantean, se ha desarrollado y adaptado mucha experiencia para varios materiales, principalmente en portainjertos de diversas especies de frutales.
Desde el año 2001 se están llevando a cabo diversos convenios de vinculación tecnológica con empresas e instituciones que agrupan a productores, obteniéndose resultados experimentales, a escala piloto de producción, muy importantes tanto para el avance de los proyectos de investigación como para el desarrollo de nuevas capacidades productivas, utilizando biotecnologías, en los sectores viveristas y semilleristas. A principios del año 2004 se estableció el primer sistema de franquicia para utilizar a escala comercial un protocolo de propagación in vitro de plantas de arándanos, como forma de apoyar la transferencia del paquete tecnológico ajustado por INIA hacia los laboratorios comerciales uruguayos. Con este mecanismo se ha buscado armonizar la demanda de plantas por parte de los productores interesados en este nuevo rubro y el interés de laboratorios comerciales y viveristas por ampliar los productos con calidad verificable que son ofrecidos a través de sus procesos de multiplicación de plantas.









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